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SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

作者: 编辑: 来源: 发布日期: 2018.10.08
信息摘要:
如何防止聚丙烯酰胺垂直电泳漏胶现象已成为实验室研究人员比较头疼的问题!1.固定玻璃板时,先将厚薄玻璃板在桌面对齐后在垂直面上稍微向厚板倾斜2…

如何防止聚丙烯酰胺垂直电泳漏胶现象已成为实验室研究人员比较头疼的问题!

 1. 固定玻璃板时,先将厚薄玻璃板在桌面对齐后在垂直面上稍微向厚板倾斜20度,使底面薄板略高于厚板。

 2. 将固定好的玻板固定于放有海绵垫的制胶架上,固定时用手稍用力往下压,此时封闭的灌胶系统准备完毕。

 3. 除了以上安装技巧外,由于海绵橡胶垫用久后会老化或者损坏,从而导致漏胶的现象时常发生,建议用户可以购买粘性高柔软性好的橡胶垫。


常见问题及分析 

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响

 在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以,pH对整个反应体系的影响是重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。

 2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

 制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,TEMED与AP:AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行;十二烷基磺酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

 3.“ 微笑”(两边翘起中间凹下)形带原因?


主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中。

 处理办法:待其充分凝固再作后续实验。

 4. “皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?


主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

 处理办法:可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡。

 5. 为什么带出现拖尾现象?


主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

 处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度。

 6. 为什么带出现纹理现象?

 主要是样品不溶性颗粒引起的。

 处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。


7. 什么是“鬼带”,如何处理?

 “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

 处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

 8. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

 处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。


9. 为什么电泳的条带很粗?

 电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因。

 处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;

 10. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。

 处理办法:电泳槽正确装配即可。 

11. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗? 

这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。


12. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?

 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。 

13. 电泳时间比正常要长?

 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。

 14.分离胶加上后为什么要立即加水?

 加入分离胶后,立即覆一层双蒸水,一是为了使分离胶界面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。


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